只需这四步！轻松建立多重荧光免疫组化检测方法

多重荧光免疫组化技术（mIHC）是一种先进的免疫化学检测方法，它能够在单个细胞或组织样本上同时检测多个目标靶点，为研究细胞组成、功能和相互作用提供了前所未有的可能性。与传统的免疫组化（IHC）相比，mIHC能够实现多因子共定位，获取更多的生物信息，且样本需求量较少。

mIHC技术的核心原理是酪氨酸信号放大（TSA）技术。该技术采用辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗，HRP催化加入体系的TSA衍生荧光染料，生成活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸共价结合，将信号共价结合到抗原上。通过多轮染色循环，mIHC能够实现组织或细胞的原位多靶点染色。

建立mIHC工作流程主要包括四个关键步骤：抗体组合开发、染色、图像采集和数据分析。

在抗体组合开发阶段，首先需要与免疫学家和疾病专家合作，确定理想的一系列生物标志物。选择抗体时，应考虑其灵敏度、特异性、再现性和优异性能。单克隆抗体通常能提供更低的背景信号、更高的特异性和更低的批次差异。随后，需要使用对照组织验证所选择的抗体组合，建立抗体的特异性、敏感性和可重复性。

染色步骤中，首先需要优化单标测定，以初步了解染色参数。然后，确定mIHC抗体组合的染色顺序，考虑生物标志物的丰度、抗原修复以及表位承受热介导的洗脱循环的能力。有时，可能需要通过增加一抗浓度、降低荧光浓度或改变抗体的染色顺序来降低伞形效应。

图像采集和数据分析是mIHC技术的关键环节。选择合适的成像仪器非常重要，整张切片的全组织成像被认为是更可靠的方法。使用具备光谱拆分的多光谱成像系统，如Akoya Biosciences PhenoImager解决方案，可以有效拆分感兴趣的每个生物标志物信号。图像采集后，使用适当的软件进行光谱拆分、分割和细胞表型分型等分析。

mIHC技术在生物医学研究中展现出巨大潜力。例如，Gang Wei等人利用mIHC技术研究透明细胞肾细胞癌（ccRCC）患者的肾周脂肪（PAT）和皮下白色脂肪（WAT）组织样本，发现肿瘤邻近脂肪细胞的解偶联蛋白1（UCP1）表达高于远端脂肪细胞。进一步的研究发现，ccRCC细胞分泌甲状旁腺激素相关蛋白PTHrP以通过PKA激活促进PAT褐变，而PAT介导的产热导致过量乳酸的释放以增强ccRCC的生长、侵袭和转移。

在另一个研究中，Halse等人运用mIHC技术对转移性黑色素瘤中的免疫亚群进行精准定位。他们量化了肿瘤内（Intra-tumor, IT）与肿瘤基质（Peri-tumoral, stroma）的免疫亚群数量，以及免疫亚群与肿瘤边缘（Tumor margin, TM）的距离。结果显示，对于黑色素瘤的MelTIL026（盆腔淋巴结）切片，大多数T细胞为CD4+T细胞，且在肿瘤边缘（TM）和间质区域（S）突出，在肿瘤内（IT）区域CD4+和CD8+T细胞数量较少。

mIHC技术的优势在于其能够提供定量分析，利用软件对组织中的细胞进行精准的结果分析。同时，mIHC不受传统染色成像的限制，可以实现多因子共定位，获取更多的生物信息。随着技术的不断进步，mIHC有望在肿瘤机制研究、免疫治疗评估、药物开发等多个领域发挥重要作用，为精准医疗的发展提供有力支持。